Spektrofotometri Pendar Flor

Pancaran cahaya oleh molekul yang ditembakkan dengan penyerapan sinar tampak dan UV menjadi dasar dari spektroskopi pendar flor, karena mengingat biayanya yang cukup murah dan kepekaan analisisnya yang tinggi sehingga teknik ini banyak digunakan dalam analisis kuantitatif obat serta metabolit. Penerapan spektroskopi pendar flor berdasarkan pada hubungan antara kadar analit dengan intensitas pendar. Tetapi sifat dari pita spektra pendar terletak pada spektrum elektromagnet, bentuk pita, umur pancaran dan intensitas pendar.

Kepekaan dan keselektifan yang tinggi dari spektroskopi pendar cukup dikenal namun tidak sepopuler dengan metode lain. Spektra pendar sangat bergantung pada striktur molekul, lingkungan molekul dan fotokimia.

Spektra pendar berasal dari peralihan elektronik pada molekul aromatik tersulih terfungsional. Intensitas pendar diamati dari suatu jenis molekul tertentu tergantung pada daya serap molar dari perpindahan terteral dan hasil kuantum pendaran, pendar flor dan silangan antarsistem. Daya serap molar menentukan bilangan molekul yang akhirnya mencapai pada kedudukan singlet terteral terendah.

Lebih pentingnya lagi yaitu hasil dari kuantum pendaran, pendar flor dan silangan antarsistem yang dapat mempengaruhi intensitas pendar kira-kira lebih dari 4 peringkat dan menentukan apakah pendar dapat atau tidak dapat diamati sama sekali. Hasil kuantum pendaran bergantung pada laju pendaran dan laju proses pesaing pendaranuntuk pengaktifan kembali kedudukan singlet terteral terendah.

Energi dari kedudukan dasar dan singlet terteral terendah dari molekul berpendar dipengaruhi oleh sifat struktur molekul seperti adanya penyulih dan geometri molekul. Hal ini diperlihatkan dari posisi (energi) dari maksimumnya pita pendar. Tetapi kebanyakan spektrometer pendaran mencatat spektra dengan sumbu spektra secara lurus pada panjang gelombang.

Peralatan pendaran dasar dapat digolongkan dalam 2 kelompok yaitu fluorometer penyaring dan spektrofluorometer. Peralatan penyaring menggunakan penyaring penggal atau penyaring pita polos, yang membiarkan daerah spektra yang lebar radiasi terteral dan pancar lewat. Penggunaan pita lolos lebar sangat mengurangi hilangnya energi pada monokromator dalam alat penapis dibanding dengan spektrofluorometer. Oleh karena itu fluorometer penyaring cenderung lebih peka tetapi kurang selektif dibanding alat bermonokromator.

Spektrofluorometer umumnya terdiri dari

  1. sumber peneral yang terdiri bermacam-macam lampu,
  2. monokromator yang memisahkan cahaya peneral menjadi panjang gelombang komponennya,
  3. tempat terokan,
  4. monokromator yang menebarkan radiasi pancar dari terokan menjadi panjang gelombang komponennya,
  5. sistem fotodetektor yang mengubah cahaya pancar ketengara dan
  6. sistem pembaca untuk menetapakan intensitas cahaya pancar pada panjang gelombang tertentu.

Alat yang memakai monokromator untuk memilih panjang gelombang cahaya peneral dan pemancar disebut spektrometer pendaran, spektroflurometer atau spektrofotofluro-meter. Sumber peneral yang sering digunakan baik pada alat penyaring maupun spektrofluorometer adalah lampu peluah gas. Radiasi pancarnya berasal dari peionan listrik dari gas atau campuran gas latu bertegangan tinggi. Lampu peluah bertekanan rendah hanya memancarkan suatu cahaya berpanjang gelombang tertentu yang umumnya berupa spektra garis (satu warna). Jika tekanan dan suhu lampu dinaikkan maka garis pancar gas melebar menjadi pita.

Pemilihan panjang gelombang peneral dibuat dengan menepatkan monokromator pemancar pada panjang gelombang yang akan memungkinkan cahaya terpancar jatuh pada detektor dan memancar pada keseluruhan spektum dari panjang gelombang peneral untuk terokan tertentu. Pemilihan panjang gelombang peneral berujuan untuk menganalisis yang berdasar pada daya pendar (kepekaan) dan pemisahan dari puncak peneral dari bahan pengikut.

Kebanyakan spektrofotometer dalam pedagangan memakai kisi lentur atau prisma kuartz sebagai monokromator. Prisma atau kisi diletakkan pada pemutar yang jika nyalakan memungkinkan cahaya berbagai macam panjang gelombang dipusatkan melalui suatu celah.

Parameter terpenting dalam menentukan daya pisah spektrofluorometer adalah lebar celah. Celah tetap memusatkan cahaya monokromator dan detektor dan mengatur jangka panjang gelombang yang merangsang terokan dan akhirnya melewati detektor. Makin kecil celah dipakai maka makin sempit jangka pita lolos spektra dan makin besar keselektifan analisis.

Terokan yang akan dianalisis diisikan dan dilateral diruang terokan yang biasanya dicat dengan warna hitam untuk menekan cahaya tersesat. Pada kebanyakan alat ruang terokan ditempatkan sedemikian sehingga cahaya terpancar dari terokan diukur tegak lurus terhadap garis masuk cahaya peneral. Kebanyakan ruang terokan dirancang sehingga dapat menampung perlengkepan seperti prisma pengutub, perlengkapan termostik dan perlengkapan suhu rendah.

Sel terokan yang paling banyak digunakan adalah pada spektroskopi pendaran suhu kamar adalah sel silika dilebur atau kuarz 1 cm2 . sel silika lebih baik karena kurang menunjukkan latar belakang pendaran dibanding sel kuartz. Tabung kuartz silinder juga sering digunakan pada pekerjaan suhu rendah karena sel kuartz biasanya tidak tahan terhadap pendinginan terokan yang cepat. Sel kuartz menguntungkan karena cahaya tebar kurang dan jauh lebih mudah dicuci daripada tabung silinder.

Sistem detektor yaitu tabung photomultipler banyak dipakai sebagai penyidik pada spektrofluorometer biasa. Tabung ini menghasilkan arus listrik bila diterangi cahaya. Amplifer meningkatkan arus foto kecil menghasilkan arus terukur. Tabung foto tidak menanggapi panjang gelombang yang sama sehingga tegangan listrik yang diberikan oleh tabung foto tidak benar-benar menyatakan intensitas relatif spektrum panjang gelombang yang diterima tetapi agak dibiaskan kedaerah panjang gelombang tertentu dari spektrum sinar tampak dan UV, sehingga menimbulkan pemilihan spektra.

Pembacaan tengara pada spektroskopi pendaran dapat diambil dengan perekam, galvometer atau osiloskop. Meter (galvanometer) yang terdapat pada spektrofotometer cocok untuk pengukuran pendaran pada panjang gelombang tetap, tetapi jarang digunakan pada kerja spektra, karena spektrum harus dirajah dengan tangan dari masing-masing pembacaan pada galvanometer.